1858年，位于Georgetown的培根学院改名为Kentucky University，迁至Harrodsburg，但不久在南北战争中毁于战火。1865年，校园被毁的Kentucky University与财政遇到困难的特兰西瓦尼亚大学合并，校名仍然为Kentucky Univeristy，校园则迁至特兰西瓦尼亚大学所在的莱克星顿。在Morrill政府特许地学院法案的资助下（该法案规定每个州可以从联邦政府得到30000英亩的土地，用于建立教授军事，工程与农学的学院），肯塔基大学农业和机械学院成立，1869年该学院授予第一个学位，同年詹姆斯·肯尼迪·佩特森出任校长。1878年由于指导思想不和，学校分裂，一部分保留Kentucky University的名字，后来改回原名特兰西瓦尼亚大学，另一部分于1879年改名为肯塔基农业和机械学院，莱克星顿市为其提供额外资助，并捐赠了52英亩的土地（肯塔基大学校园的中心部分），即今肯塔基大学的前身。

1880年，学校开设师范学院，开始招收女学生，但女生没有获得学位的资格，1888年才第一次授予女性学位。1904年，第一座女生宿舍楼Patterson Hall建成，这也是中心校园之外的第一座建筑，住在这里的学生需要穿越一片积水的湿地（即学生活动中心）才能到教室上课。Patterson Hall后被翻新，成为肯塔基大学现存最老的学生宿舍。

1908年，学校改名为州立肯塔基大学。1910年担任四十年校长职务的James Kennedy Patterson退休。1916年学校改名为肯塔基大学（University of Kentucky）。1949年，黑人学生Lyman T. Johnson胜诉，得以进入研究生院就读。1954年起肯塔基大学废除对学生入学的种族要求。